Вторичный, или коагуляционный, гемостаз обеспечивает плотную закупорку поврежденных сосудов красным тромбом, состоящим из сети волокон фибрина с захваченными ею клетками крови (тромбоцитами, эритроцитами и др.).
Упрощенная схема свертывания крови:
1)под влиянием «активатора протромбина» — тромбокиназы, образующейся при повреждении тканей, агрегации и разрушении тромбоцитов, и в результате сложных химических взаимодействий факторов свертывания крови, белок плазмы протромбин превращается в тромбин
2)тромбин в свою очередь, расщепляет растворенный в плазме фибриноген с образованием фибрина, волокна фибрина образуют основу тромба
Через несколько часов они активно сжимаются — происходит ретракция сгустка, в результате которой из него выдавливается светлая жидкость — сыворотка.
Свертывание крови в целом представляет собой многоступенчатый каскадный процесс, протекающий с участием многочисленных факторов свертывания. Все факторы присутствуют в плазме в неактивной форме. Они обозначаются римскими цифрами и соответствующими названиями, в которых отражена их функция. Для обозначения активированных факторов свертывания добавляется буква «а».
Следует помнить также, что фактор VI изъят из классификации, так как представляет собой активированный фактор V. Некоторые из факторов свертывания не имеют цифровых обозначений.
Процесс свертывания крови принято условно разделять на две основные фазы:
•Фаза активации — многоступенчатый этап свертывания, завершающийся активизацией протромбина (фактор II) с превращением его в активный фермент тромбин (фактор IIа).
•Фаза коагуляции — конечный этап свертывания, в результате которого под влиянием тромбина фибриноген (фактор I) превращается в фибрин.
Фаза активации
Центральным звеном сложных химических превращений этой фазы является образование так называемого «активатора протромбина», который представляет собой ферментный комплекс, состоящий из активированных факторов свертывания Ха, Va, ионов Са2+ и фосфолипопротеидов.
Источником последних могут быть:
•фосфолипопротеиды, высвобождающиеся при повреждении тканей, в частности, эндотелия сосудов или соединительной ткани (тканевой тромбопластин — фактор III)
•фосфолипопротеиды мембран тромбоцитов, выходящие в плазму при их разрушении (тромбоцитарный фактор 3)
Таким образом, формирование ключевого ферментного комплекса этой фазы — «активатора протромбина» — происходит двумя путями, в соответствии с которыми различают две системы свертывания:
1.Внешняя система, которая активируется при повреждении тканей в течение нескольких секунд. Фосфолипопротеиды, выходящие из тканевых клеток (тканевой тромбопластин, или фактор III), в присутствии ионов Са2+ активируют фактор VII (проконвертин). Последний в комплексе с фосфолипопротеидами поврежденной ткани и ионами Са2+, в свою очередь, активирует фактор Х, входящий затем в состав “активатора протромбина”.
2.Внутренняя система, активация которой происходит несколько медленнее (в течение минут) и без участия тканевого тромбопластина. Пусковым фактором этого механизма является фактор XII (фактор Хагемана), который активируется двумя путями:
•при контакте крови с коллагеном субэндотелия поврежденного сосуда или с любой чужеродной поверхностью (стеклом, металлом, каолином и т. д.)
•при ферментативном расщеплении фактора Хагемана протеолитическими ферментами (калликреином, тромбином, трипсином и др.) с участием высокомолекулярного кининогена (ВМК)
Фактор ХIIа активирует фактор XI. Последний, в свою очередь, активирует фактор IX. Наконец, фактор IХа образует ферментный комплекс с фосфолипопротеидами, высвобождающимися при разрушении тромбоцитов (т. е. с тромбоцитарным фактором 3), который в присутствии ионов Са2+ и плазменного фактора VIIIа (фактора Виллебранда) активирует фактор X. Последний также входит в состав “активатора протромбина”. Образовавшийся двумя путями ключевой ферментный комплекс — “активатор протромбина” — протеолитически расщепляет неактивный предшественник протромбин (фактор II) (молекулярная масса 72 000), в результате чего образуется активный протеолитический фермент тромбин (молекулярная масса 35 000), представляющий собой пептидазу. Действие тромбина не ограничивается только протеолизом фибриногена на следующем этапе свертывания крови. Тромбин способствует также необратимой агрегации тромбоцитов, а также активирует ряд факторов свертывания (V, VIII, XIII). Следует помнить, что внешний и внутренний механизмы свертывания взаимосвязаны между собой: между отдельными их этапами существуют своеобразные «мостики» — альтернативные пути для процессов коагуляции. Так, комплекс факторов ХIIа–калликреин–кининоген (внутренний механизм) ускоряет активацию фактора VII (внешний механизм), а фактор VIIa ускоряют активацию фактора IX (внутренний механизм).
Фаза коагуляции
В течение этой фазы происходит образование фибрина из его предшественника фибриногена.
Процесс протекает в два этап:
•на первом этапе - фибриноген расщепляется тромбином на четыре растворимых мономера фибрина (по два пептида А и В), у каждого из которых имеются по 4 свободные связи
•на втором этапе - мономеры соединяются друг с другом, формируя полимеры, из которых строятся волокна фибрина
Процесс необратимой полимеризации фибрина происходит с участием фибриностабилизирующего фактора XIII в присутствии ионов Са2+.
Однако на этой стадии трехмерная сеть волокон фибрина, которая содержит эритроциты, тромбоциты и другие клетки крови, все еще относительно рыхлая. Свою окончательную форму она принимает после ретракции сгустка, возникающей при активном сокращении волокон фибрина и выдавливании сыворотки. Благодаря ретракции сгусток становится более плотным и стягивает края раны.
!!!Следует упомянуть еще об одном возможном пути превращения фибриногена в фибрин на конечной стадии свертывания крови — о так называемом феномене паракоагуляции, который наблюдается, например, при синдроме диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови (ДВС-синдроме).
В отличие от обычного (описанного выше) процесса полимеризации волокон фибрина из его мономеров, при этом синдроме значительно снижается чувствительность к тромбину и нарушается процесс полимеризации фибрин-мономеров. Это происходит в результате того, что часть фибрин-мономеров образуют с фибриногеном и продуктами его распада комплексные крупно- и среднемолекулярные соединения — растворимые фибрин-мономерные комплексы (РФМК). Они плохо реагируют на действие тромбина, обладая относительной тромбинрезистентностью, но образуют гель при добавлении к плазме этанола, протаминсульфата или бета-нафтола. Это и есть феномен неферментативного свертывания, или феномен паракоагуляции. Выявление РФМК имеет важное значение для диагностики ДВС-синдрома.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ свертывающей системы крови
Для определения состояния гемокоагуляции используют несколько групп методов:
•ориентировочные (базисные) методы, характеризующие процесс свертывания в целом, отдельные его фазы, а также дающие возможность оценить внешний и внутренний механизмы коагуляции
•методы, позволяющие дифференцировать дефицит отдельных факторов свертывания крови
•методы, позволяющие выявить внутрисосудистую активацию системы свертывания крови
К базисным методам относятся:
1.определение времени свертывания крови
2.определение времени рекальцификации стабилизированной крови (плазмы)
3.протромбиновое время (протромбиновый индекс)
4.тромбиновое время
1. Время свертывания крови
1.1 Определение времени свертывания цельной нестабилизированной крови проводится непосредственно у постели больного.
Иглой без шприца пунктируют локтевую вену. Первые капли крови выпускают на ватный тампон и набирают по 1 мл крови в 2 сухие пробирки. Включив секундомер, ставят пробирки в водяную баню при температуре 37°С. Через 2–3 мин, а затем каждые 30 с пробирки слегка наклоняют, определяя момент, когда кровь свернется. Определив время образования сгустка крови в каждой из пробирок, вычисляют средний результат.
В норме время свертывания составляет 5–10 мин.
!!! Удлинение времени свертывания свидетельствует о значительных сдвигах в системе гемокоагуляции и чаще указывает на:
•выраженную недостаточность факторов, участвующих во внутреннем механизме коагуляции
•дефицит протромбина
•дефицит фибриногена
•наличие в крови ингибиторов свертывания, в частности гепарина
1.2 Метод Моравица
В клинике до сих пор используется еще один упрощенный метод определения времени свертывания крови. Он применяется, в основном, для динамического контроля за состоянием гемокоагуляции при лечении прямыми антикоагулянтами.
На предметное стекло наносят каплю крови, взятую из пальца или мочки уха. Включив секундомер, каждые 20–30 с в каплю крови опускают тонкий стеклянный капилляр. Время свертывания определяют в момент появления первой тонкой нити фибрина при вытягивании капилляра из капли крови.
В норме свертывание крови составляет около 5 мин.
2. Активированное время рекальцификации плазмы
Метод основан на измерении времени свертывания тромбоцитарной плазмы при добавлении в нее оптимального количества кальция хлорида или каолина, что обеспечивает стандартизацию контактной активизации факторов свертывания.
В пробирку с раствором кальция хлорида или каолина, установленную в водяной бане при температуре 37°С, добавляют 0,1 мл плазмы и по секундомеру определяют время образования сгустка.
В норме время рекальцификации плазмы с кальция хлоридом составляет 60–120 с, с каолином — 50–70 с.
Изменения этого показателя неспецифичны и указывают лишь на общую тенденцию к гиперкоагуляции (укорочение времени рекальцификации) или к гипокоагуляции (увеличение показателя).
Удлинение времени рекальцификации может быть обусловлено:
•Недостаточностью большинства плазменных факторов свертывания (кроме факторов VII и XIII).
•Дефицитом тромбоцитарного фактора III (при выраженной тромбоцитопении или нарушении реакции высвобождения).
•Избыточным содержанием в плазме ингибиторов свертывания (гепарина)
•Наличием ДВС-синдрома.
3. Активированное частичное (парциальное) тромбопластиновое время (АЧТВ)
Принцип метода заключается в определении времени свертывания плазмы в условиях стандартизации не только контактной, но и фосфолипидной (тромбопластиновой) активации факторов свертывания. С этой целью к плазме добавляют смесь каолина и кефалина (тромбопластиновый активатор), а также кальция хлорид и по секундомеру определяют время свертывания плазмы.
В норме АЧТВ (кефалин-каолиновое время) составляет 35–50 с.
Уменьшение АЧТВ свидетельствует о гиперкоагуляции и склонности к тромбозам, увеличение — о гипокоагуляции крови.
!!! АЧТВ чрезвычайно чувствительно к дефициту плазменных факторов свертывания, участвующих во внутреннем механизме свертывания (факторы XII, XI, IX, VIII) и не зависит от дефицита тромбоцитов или их функциональной недостаточности (в связи с добавлением кефалина).
АЧТВ удлиняется также при наличии в крови ингибиторов свертывания (гепарина) и может быть использован как чувствительный тест для контроля за лечением гепарином.
4. Протромбиновое время (ПВ, протромбиновый индекс)
Метод представляет собой еще одну модификацию определения времени рекальцификации плазмы при добавлении в нее тканевого тромбопластина человека или кролика, что приводит к «запуску» свертывания по внешнему механизму. Тканевой тромбопластин в комплексе с фактором VII и ионом Са2+ активирует фактор X, входящий в состав «проактиватора протромбина».
В пробирку с 0,1 мл плазмы и 0,1 мл раствора тромбопластина, установленную в водяной бане при температуре 37°С, добавляют 0,1 мл раствора кальция хлорида и по секундомеру определяют время образования сгустка.
В норме протромбиновое время составляет 12–18 с и во многом зависит от активности тканевого тромбопластина, использованного при исследовании. Поэтому в большинстве случаев для определения этого показателя одновременно по той же методике исследуют плазму донора и вычисляют так называемый протромбиновый индекс (ПИ):
ПИ=(ПBд/ ПВб )*100%
где ПИ — протромбиновый индекс, ПBд и ПВб — протромбиновое время донора и больного, соответственно. В норме протромбиновый индекс составляет 90—100%. Чем больше протромбиновое время, свидетельствующее о гипокоагуляции крови, тем меньше значения протромбинового индекса.
Удлинение протромбинового времени (уменьшение протромбинового индекса) интегрально отражает недостаточность плазменных факторов, участвующих во внешнем механизме свертывания и в активации протромбина (VII, X, V), а также на конечных этапах коагуляции (I и II).
Наиболее частыми причинами такого изменения являются:
•Прием непрямых антикоагулянтов (фенилин, синкумор, неодикумарин и др.).
•Дефицит соответствующих витамин К-зависимых факторов свертывания (факторы II, VII, IХ, X) при тяжелых поражениях паренхимы печени (гепатит, цирроз, рак) и недостаточности витамина К (механическая желтуха, нарушения всасывания в кишечнике, дисбактериоз кишечника и т. п.).
•Дефицит фибриногена (гипофибриногенемия), являющегося К-независимым фактором свертывания (тяжелые поражения паренхимы печени и др.).
•Наличие феномена паракоагуляции, в частности, при ДВС-синдроме.
МНО (Международное нормализованное отношение, INR) - показатель системы свертывания крови.
•Основные показания к применению: лечение антикоагулянтами непрямого действия – варфарином, аценокумаролом и другими аналогами.
•МНО – показатель, рассчитывающийся при определении протромбинового времени.
•Определение МНО гарантирует возможность сравнения результатов при определении ПВ, обеспечивая точный контроль терапии непрямыми антикоагулянтами.
•Для диагностики нарушений свертывания крови используют показатель ПВ, выражающийся в секундах.
•В тех случаях, когда определение ПВ применяют для оценки проведения лечения варфарином, используется показатель МНО - международное нормализованное отношение (INR - International Normalized Ratio).
•Этот показатель позволяет выразить результаты ПВ с учетом использования в различных лабораториях коммерческих препаратов тромбопластина, используемого в определении ПВ.
•Такой подход гарантирует возможность сравнения результатов полученных в разных лабораториях и проводить более точный контроль при лечении антикоагулянтами непрямого действия.
•МНО вычисляется при делении ПВ пациента на значение нормального ПВ, далее результат возводится в степень, показатель которой равен международному индексу чувствительности (ISI или МИЧ - международный индекс чувствительности) тромбопластина:
МНО = (ПВ пациента/среднее нормальное ПВ)
•Доза антикоагулянта подбирается так, что бы поддерживать МНО на необходимом уровне, в зависимости от заболевания.
•Наиболее часто используемым антикоагулянтом непрямого действия в клинической практике является варфарин.
•Применять анализ целесообразно с одновременным определением АЧТВ (активированное частичное тромбопластиновое время).
Референтные значения МНО:
•В каждом конкретном случае необходимо поддерживать МНО на определенном уровне. Дозы назначаемого препарата выбираются лечащим врачом.
•В норме: МНО = 0,8 - 1,15.
•При лечение венозного тромбоза: МНО = 2,0-3,0.
•Лечение артериальной тромбоэмболии, рецидивирующей системной эмболии: МНО= 3,0 -4,0.
•Профилактика пристеночных тромбозов при мерцательной аритмии: МНО=1,5-2.
Факторы искажающие результат:
•Недостаточное наполнение пробирки кровью, недостаточное перемешивание крови с антикоагулянтом, а также несвоевременная отправка пробы в лабораторию.
•Гемолиз вследствие травматичной пункции вены или небрежного обращения с пробой крови.
Увеличение показателя МНО:
•Болезни печени.
•Дефицит витамина К.
•Внутрисосудистое свёртывание.
•Наследственный дефицит факторов II (протромбин), V, VII, X.
•Афибриногенемия.
•Гипофибриногенемия (уровень фибриногена менее 50 мг/100 мл).
•Дисфибриногенемия.
•Лечение кумарином.
•Циркулирующие антикоагулянты.
____________________________________________________________________________________________________________________________
5. Тромбиновое время
Метод оценки тромбинового времени заключается в определении времени свертывания плазмы при добавлении в нее тромбина со стандартной активностью, который обладает способностью индуцировать превращение фибриногена в фибрин без участия других факторов свертывания крови.
В пробирку с 0,2 мл плазмы, установленную в водяной бане при температуре 37°С, добавляют 0,2 мл стандартного раствора тромбина и по секундомеру определяют время образования сгустка. В норме тромбиновое время составляет 15–18 с.
Определение тромбинового времени позволяет оценить конечный этап свертывания крови (превращение фибриногена в фибрин). Тромбиновое время, таким образом, зависит от концентрации фибриногена, его свойств и наличия в крови ингибиторов тромбина (гепарин, антитромбин III).
Причинами удлинения тромбинового времени являются:
•Афибриногенемия и гипофибриногенемия.
•ДВС-синдром и другие патологические состояния, сопровождающиеся феноменом паракоагуляции с нарушением процесса полимеризации фибрина и нарастанием концентрации в крови продуктов деградации фибрина (ПДФ).
•Тяжелые поражения белковосинтетичекой функции печени, сопровождающиеся снижением синтеза фибриногена.
•Острый фибринолиз.
•Увеличение в крови концентрации ингибиторов тромбина (антитромбина III, гепарина).
Определение тромбинового времени используется для контроля за лечением гепарином и фибринолитиками.
6. Аутокоагуляционный тест (АКТ)
Метод заключается в исследовании динамики образования и инактивации тромбина в разведенной в 20 раз и гемолизированной крови пациента при добавлении гипотонического раствора кальция хлорида. Оценивается свертывающая активность гемолизат-кальциевой смеси с помощью гемокоагулографа.
Гемолизированные эритроциты обеспечивают контактную и фосфолипидную активацию процесса свертывания (подобно каолину и кефалину при исследовании активированного частичного тромбопластинового времени). Таким образом, аутокоагуляционный тест оказывается чувствительным к нарушениям внутреннего механизма свертывания.
Показатель
А - Свертывающая активность на 2-й мин инкубации, %
Нормальные величины = 15,5 ± 3,0 Показатель
МА - Максимальная свертывающая активность, %
Нормальные величины = 100 ± 1,1 Показатель
T1 - Время достижения 1/2 максимальной активности, мин
Нормальные величины = 3,7 ± 0,2 Показатель
Т2 - Время достижения максимальной активности, мин
Нормальные величины = 9,5 Показатель
Т - Время от начала инкубации до момен-та, когда активность снижается до 1/2 МА
Нормальные величины = 35
Увеличение значений T1 и Т2, а также уменьшение А и МА свидетельствуют о гипокоагуляции, которая может быть обусловлена:
•дефицитом факторов внутреннего механизма свертывания (XII, XI, IX, VIII)
•дефицитом факторов X и V (“проактиватора протромбина”)
•дефицитом факторов конечного этапа коагуляции (I и II)
•избытком ингибиторов тромбина (гепарин, антитромбин III и др.)
7. Тромбоэластография
Широкое распространение в клинической практике получил метод тромбоэластографии, который позволяет регистрировать свертывание крови и изменения упругости сгустка крови во времени (ретракцию и лизис).
Основной частью любого типа тромбоэластографа (гемокоагулографа) является кювета, в которую вносят исследуемую кровь. В кювету погружают стержень с диском или пластиной на конце, которая не касается ее стенок. Стержень связан с регистрирующим устройством тромбоэластографа. Специальное устройство придает кювете колебательно-вращательные движения, которые могут передаваться на стержень (и регистрирующее устройство), только когда в кювете, заполненной кровью, начнется образование нитей фибрина. По мере образования и уплотнения сгустка амплитуда колебаний стержня увеличивается и достигает максимума.
Предложено множество количественных показателей тромбоэластограммы, три из которых заслуживают внимания:
1.Время реакции (R) — время от начала исследования до начала свертывания крови (первых отклонений тромбоэластограммы от прямой линии).
2.Время коагуляции (К) — время от начала движений стержня прибора до момента, когда амплитуда тромбоэластограммы составит 20 мм.
3.Максимальная амплитуда (МА) тромбоэластограммы.
Считается, что время R характеризует в основном первую фазу коагуляции, а время К - интенсивность образования фибрина. Нормальные величины приведенных трех показателей тромбоэластограммы обычно устанавливают эмпирически для каждого прибора. В среднем у здоровых людей время реакции (R) составляет 4-10 мин, время коагуляции (К) — 5-7 мин, а максимальная амплитуда (МА) - 45-65 мин.
!!! Для гиперкоагуляции крови характерно укорочение R, К и увеличение МА, а для гипокоагуляции — удлинение R и К и уменьшение МА.
Следует отметить, что в целом чувствительность тромбоэластографии к нарушениям гемокоагуляции достаточно низкая, сопоставимая с чувствительностью времени свертывания крови, а тромбоэластографические показатели лишь весьма приблизительно отражают отдельные стадии процесса коагуляции. Тем не менее, тромбоэластография может использоваться в клинике для динамического контроля за лечением антикоагулянтами.
Принципы оценки базисных методов диагностики нарушений коагуляционного гемостаза
Оценка свертывания крови с помощью описанных базисных тестов позволяет составить общее ориентировочное представление о процессе коагуляции крови. При этом следует иметь в виду, что такие показатели как время свертывания крови и время рекальцификации плазмы обладают весьма низкой чувствительностью и специфичностью, и, следовательно, информативностью: они изменяются, как правило, лишь при выраженных нарушениях коагуляции крови и не позволяют судить (хотя бы предположительно) о повреждениях отдельных ее механизмов и этапов.
Преимуществом в этом отношении обладают три базисных теста:
1.тромбиновый
2.протромбиновый
3.АЧТВ или АКТ (их изменения сходны)
Они позволяют судить не только о состоянии всей свертывающей системы в целом, но и о возможной недостаточности отдельных факторов свертывания. •При дефиците фактора VII (проконвертина), участвующего только во внешнем механизме свертывания, удлиняется только протромбиновое время, а тромбиновый тест и АЧТВ остаются без изменения.
•При дефиците факторов XII, XI, IX, VIII и прекалликреина, участвующих только во внутреннем механизме коагуляции, изменяются АЧТВ (и АКТ), а протромбиновое и тромбиновое время свертывания остаются нормальными.
•При дефиците факторов X, V, II, на которых замыкаются оба механизма свертывания, нарушения обнаруживаются как в протромбиновом тесте, так и в АЧТВ. Тромбиновое время при этом не изменяется.
•Наконец, при нарушениях количества, структуры и свойств фибриногена (фактор I) изменения выявляются при выполнении всех трех базисных тестов. При этом целесообразно также оценить уровень фибриногена в сыворотке крови (см. ниже).
•При дефиците фактора XIII показания всех трех базисных тестов оказываются нормальными.
Дальнейшее уточнение механизмов нарушения коагуляции крови производят с помощью дифференцирующих тестов, подробно описанных в специальных руководствах.
Наибольшее распространение в клинической практике получили два метода определения фибриногена:
1.Гравиметрический метод заключается в высушивании и взвешивании сгустка, который образуется при добавлении в плазму 0,2 мл стандартного раствора тромбина.
2.Колориметрический метод также основан на превращении фибриногена в фибрин путем добавления в плазму раствора тромбина. Фибриновый сгусток подвергают гидролизу, а в гидролизат добавляют биуретовый реактив (см. выше) и колориметрируют, определяя концентрацию белка.
Оба метода дают близкие результаты. Содержание фибриногена в плазме здорового человека составляет 2–4 г/л.
Нередко встречается увеличение концентрации фибриногена. Наиболее частыми причинами гиперфибриногенемии являются:
•острые инфекционные заболевания
•острые и хронические воспалительные заболевания
•злокачественные новообразования
•тромбозы и тромбоэмболии, в том числе у больных острым инфарктом миокарда, ишемическим инсультом и т. п.
9. Определение высокомолекулярных производных фибриногена
Наиболее важными в практическом отношении высокомолекулярными производными фибриногена являются:
1) Растворимые фибрин-мономерные комплексы (РФМК) - представляет собой высокомолекулярные растворимые комплексы фибрин-мономера с фибриногеном и с продуктами расщепления фибриногена/фибрина. В норме РФМК не обнаруживаются. Появление РФМК в плазме свидетельствует о нарушении процесса нормальной полимеризации фибрин-мономеров. РФМК плохо коагулируют под влиянием тромбина, обладая относительной тромбинрезистентностью
2) Продукты деградации фибриногена (ПДФ) - в небольших количествах образуются и в норме в результате расщепления фибрина, присутствующего в плазме и в отложениях, под влиянием плазмина (см. ниже). Повышение содержания ПДВ - признак усиливающегося внутрисосудистого свертывания крови или массивных тромбоэмболий, сопровождающихся активацией фибринолитической системы.
Определение растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК). Для выявления РФМК в клинике чаще используются так называемые паракоагуляционные тесты. Они основаны на феномене неферментативного свертывания РФМК: при добавлении к плазме, в которой содержатся РФМК, 50% раствора этанола или 1% раствора протамина сульфата из растворимых комплексов фибрин-мономера с продуктами расщепления фибриногена/фибрина и фибриногеном высвобождаются фибрин-мономеры, которые затем полимеризуются с образованием геля. Проба с 50% раствором этанола является более чувствительной. В пробирку набирают 0,15 мл 50% этанола и 0,5 мл плазмы. Пробирку встряхивают и помещают в штатив при комнатной температуре. Проба расценивается как положительная, если через 1–10 мин в пробирке образуется гель. Помутнение или появление небольшой зернистости является признаком отрицательной пробы (нормальный показатель). Проба с протамина сульфатом позволяет выявить не только полимеризацию фибрин-мономеров, высвобождающихся из РФМК, но и обнаружить осаждение ранних продуктов расщепления фибриногена/фибрина.
Перед началом исследования предварительно готовят 5 разведений 1% раствора протамина сульфата (в 5, 10, 20, 40 и 80 раз). В каждое из приготовленных разведений добавляют 0,2 мл плазмы. Пробирки оставляют на 30 мин при комнатной температуре. Оценка результатов проводится так же, как и в пробе с этанолом. В норме отрицательный результат обнаруживают во всех разведениях протамина сульфата. Если хотя бы в одном из разведений образуется гель, результат оценивается как положительный.
Положительная проба с этанолом, а также положительный результат протаминсульфатной пробы в первых 1–2 разведениях свидетельствует о наличии в плазме РФМК. Образование геля во всех разведениях протамина сульфата больше характерно для повышения уровня ранних продуктов расщепления фибриногена/фибрина.
!!! Положительные результаты обеих проб встречаются при ДВС-синдроме или массивных тромбозах и тромбоэмболиях, сопровождающихся активацией системы фибринолиза.
Определение продуктов деградации фибрина (ПДФ). Для определения ПДФ в крови используют различные иммунологические и неиммунологические методы. Наиболее простым из них является проба с протамина сульфатом. В пробирку набирают 0,4 мл свежей сыворотки крови и добавляют 0,1 мл 1% раствора протамина сульфата. Помутнение или мелкую зернистость оценивают как отрицательный результат (норма), а образование геля, хлопьев или нитей фибрина — как положительный, свидетельствующий о повышении содержания ПДФ в сыворотке крови больше 0,015 г/л.
В основе иммунодиффузного метода определения ПДФ лежит образование дуг преципитации на агаровой пластине, на которую наносят на определенном расстоянии друг от друга исследуемую и антифибриногеновую сыворотки. Обычно используют стандартную антисыворотку, которую помещают в центральные лунки на агаровой пластинке. В периферические лунки вносят исследуемую сыворотку в различных разведениях (в 2, 4, 8, 16 и 32 раза). Результат определяют через сутки инкубации при комнатной температуре. При повышении в сыворотке ПДФ более 0,016–0,020 г/л на агаровой пластинке определяются дуги преципитации. Если известна чувствительность стандартной антифибриногеновой сыворотки, иммунодиффузный метод позволяет количественно определять содержание ПДФ в исследуемой сыворотке.
!!! Повышение концентрации ПДФ в сыворотке крови более 0,015 г/л чаще всего наблюдается:
•при ДВС-синдроме
•при массивных тромбозах и тромбоэмболиях, сопровождающихся активацией фибринолиза
•при лечении фибринолитическими препаратами
ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АНТИКОАГУЛЯНТЫ
В условиях физиологической нормы постоянно встречаются ситуации, которые «запускают» процесс плазмокоагуляции. Ограничение этого процесса осуществляется с помощью так называемых физиологических антикоагулянтов, которые, будучи естественными ингибиторами различных факторов коагуляции, тормозят начавшееся свертывание крови.
Различают две группы физиологических антикоагулянтов:
1.первичные, постоянно содержащиеся в крови - антитромбин III, гепарин, протеин С, a2-макроглобулин и др.
2.вторичные — образующиеся только в процессе свертывания крови и фибринолиза
Антитромбин III является важнейшим ингибитором свертывания, на долю которого приходится 3/4 активности всех физиологических ингибиторов коагуляции. Он инактивирует все ключевые факторы свертывания: тромбин (IIа), фактор Ха, IХа, ХIа, VIIa, XIIa. Кроме того, антитромбин III является плазменным кофактором гепарина, образуя с ним комплекс, обладающий выраженными антикоагулянтными свойствами. Антитромбин III и гепарин взаимодействуют с факторами свертывания и порознь, но в этом случае ингибирование обратимо.
!!!Дефицит антитромбина III (наследственный или приобретенный) сопровождается тяжелым тромботическим состоянием, характеризующимся рецидивирующими тромбозами магистральных вен конечностей и внутренних органов, тромбоэмболиями легочной артерии, инфарктами различных органов. При этом антикоагулянтная активность гепарина, вводимого парентерально, резко снижается из-за отсутствия кофактора — антитрипсина III.
К другим первичным антикоагулянтам относятся:
•гепарин — ингибитор поливалентного действия, ограничивающий все фазы плазмокоагуляции, особено в комплексе с антитромбином III
•a2-макроглобулин — белок, являющийся ингибитором тромбина, плазмина, калликреина
•протеин С — витамин-К-зависимый физиологический антикоагулянт, инактивирующий факторы VIII и V при участии двух кофакторов (протеина S и тромбомодулина).
•a-антитрипсин I — ингибитор тромбина, факторов IXa, XIa, XIIa, плазмина и калликреина и др
Из вторичных физиологических антикоагулянтов, образующих в процессе начавшегося свертывания и фибринолиза, наибольший практический интерес вызывают:
•фибрин - обозначаемый антитромбином I
•продукты деградации фибриногена/фибрина (ПДФ)
!!!Образующийся в процессе коагуляции плазмы фибрин и являющийся по сути конечным продуктом этого процесса одновременно адсорбирует и инактивирует большие количества тромбина и фактора Ха, т. е. функционирует и как физиологический антикоагулянт.
!!! Продукты деградации фибриногена/фибрина (ПДФ), образующиеся в результате действия плазмина, ингибируют как агрегацию тромбоцитов, так и процесс полимеризации фибрин-мономеров, т. е. конечный этап свертывания — образование фибрина.
В клинической практике наибольшее распространение в последние годы получило определение функциональной активности антитромбина III как важнейшего физиологического антикоагулянта. Методы основаны на оценке интенсивности инактивации стандартных доз тромбина с регистрацией по времени свертывания или на количественном определении содержания в плазме антигена антитромбина III с применением стандартных антисывороток (иммунологический метод).