Концепция биопленок затрагивает инфекционные поражения большинства органов (верхних дыхательных путей, легких, сердца, почек, кожи, костей, системы пищеварения) и практически всех искусственных имплантатов. Среди всех инфекционных поражений около 65 - 80% вызываются бактериями, формирующими биопленки. При таких, на первый взгляд, совершенно различных заболеваниях, как пневмония, цистит и инфицированный протез коленного сустава, благодаря общности патогенеза могут использоваться сходные стратегии лечения, сфокусированные на подавление биопленок.
Более 150 лет назад Роберт Кох разработал метод чистой культуры для выделения индивидуальных штаммов бактерий. Эти подходы и по сей день широко используются в микробиологии, однако рост отдельных клеток планктонных (свободно плавающих) бактерий в среде, богатой питательными веществами, существенно отличается от их существования в естественных условиях, в том числе в организме человека. Обычно планктонный фенотип бактерий встречается лишь транзиторно и в минимальном количестве (как способ перемещения микробной клетки от одной поверхности к другой), тогда как преимущественно бактериальные популяции представляют собой биопленки - полимикробные фиксированные сообщества микроорганизмов, внедренные в синтезированный ими полимерный матрикс. Такая форма существования предоставляет бактериям массу преимуществ в условиях воздействия неблагоприятных факторов внешней среды и организмхозяина. Представления о биопленках, подтвержденные с помощью современных методов визуализации, изменили взгляды на инфекционные заболевания. Всё новые данные свидетельствуют о том, что хронические инфекции принципиально отличаются от острых, а существование биопленок при хронических инфекциях требует совершенно новых подходов к их диагностике и лечению.
Биопленка - это сообщество микробов (бактерий), которые прикреплены к поверхности или друг к другу, заключены в матрикс синтезированных ими внеклеточных полимерных веществ, имеют измененный фенотип, проявляющийся другими параметрами роста и экспрессии специфичных генов (матрикс биопленки пронизан каналами, по которым циркулируют питательные вещества, продукты жизнедеятельности, ферменты, метаболиты и кислород). Это определение позволяет отличить микробные сообщества биопленок от похожих на них лишь внешне структур, например колоний бактерий, растущих на поверхности агара, которые не соответствуют характеристикам, свойственным истинной биопленке.
Биопленки – это основной фенотип почти всех бактерий в естественных условиях обитания, как во внешней среде, так и в организме человека при патологии, причем сами бактерии составляют лишь 5 - 35% массы биопленки, остальная часть - межбактериальный матрикс; в химическом отношении матрикс неоднороден и различается у разных микроорганизмов. Экстрацеллюлярный слой со держит до 40 - 95% полисахаридов. Концентрация других химических компонентов очень сильно варьирует. Доля белков может составлять до 60%, липидов до 40% и нуклеиновых кислот 1 - 20%. Данные соединения находятся в гидратированном состоянии, так как 80 - 90% объема биопленки занимает вода.
Образование биопленок – это сложный комплексный динамический процесс, состоящий из нескольких этапов. Выделяют пять стадий развития бактериальной биопленки: 1- первичное прикрепление микроорганизмов к поверхности (адгезия) из окружающей среды (обычно жидкости); 2 - окончательное, необратимое, прикрепление (иначе называемое фиксацией); 3 - созревание биопленки; 4 - рост и образование взрослой зрелой биопленки в белково-полисахаридном каркасе; 5 - дисперсия (выброс бактерий или отделение), при которой периодически от зрелой биопленки отрываются отдельные клетки, способные через некоторое время прикрепиться к поверхности и образовать новую колонию (важно отметить, что бактерии, включенные в матрикс фрагментов, которые отрываются от биопленок на колонизированном медицинском устройстве и циркулируют в жидкостях тела, устойчиво проявляют все фенотипические характеристики исходной биопленки). Изначальное прикрепление микробной клетки к поверхности субстрата осуществляется за счет действия электростатических, гидрофобных сил, сил Ван дер Ваальса, неспецифической адгезии. Адгезия к биологическим поверхностям (к клеткам тканей, стенкам сосудов) обусловливается специфическим взаимодействием белков-адгезинов или лектинов фимбрий экзоплазматического компартмента бактериальной клетки с рецепторами или определенными доменами поверхности мембран хозяйских клеток. Основные этапы образования биопленки (адгезия; созревание, рост и образование взрослой зрелой биопленки; отделение) показаны на рисунке:
Как быстро образуется биопленка? Экспериментальные лабораторные исследования показали, что планктонные бактерии, например стафилококки, стрептококки, псевдомонады, кишечная палочка обычно: присоединяются друг к другу в течение нескольких минут; образуют прочно присоединенные микроколонии в течение 2 - 4 часов; вырабатывают внеклеточные полисахариды и становятся значительно более толерантными к биоцидам, например, к антибиотикам, антисептикам и дезинфектантам, в течение 6 - 12 часов; вовлекаются в полноценные колонии биопленки, которые очень устойчивы к биоцидам и теряют планктонные бактерии в течение 2 - 4 дней в зависимости от видов бактерий и условий роста; быстро восстанавливаются после механического разрушения и вновь формируют зрелую биопленку в течение 24 часов.
В настоящее время известно, что бактерии способны колонизировать и формировать биопленки на любых медицинских имплантатах, катетерах, эндотрахеальных трубках и т.д. Это серьезная проблема в медицинской практике, поскольку в хирургических и реанимационных отделениях клиник широко используются различные инвазивные материалы. Образование биопленок при этом ведет к возникновению тяжелых катетер-, вентилятор-ассоциированных инфекционных осложнений, сепсисов. По результатам опытов in vitro установлено, что степень адгезии с последующим формированием биопленок наиболее выражена к таким материалам, как латекс, силикон, поливинилхлорид. Адгезия к тефлону, полиуретану, нержавеющей стали и титану проявляется в меньшей степени.
Биопленки предоставляют защиту от факторов внешней среды и могут включать микроорганизмы разных царств (например, бактерии и грибы). Благодаря существованию в виде биопленок популяция бактерий усиливает свою защиту от фагоцитоза, ультрафиолетового излучения, вирусов и дегидратации, а также от антибиотиков и факторов иммунной защиты макроорганизма. В частности, биопленки оказались способными выдерживать концентрации антибиотиков в 100 - 1000 раз больше, чем подавляющие планктонные клетки (El-Azizi M. et al., 2005.). Аналогичным образом, фагоциты макроорганизма неспособны поглощать биопленки в отличие от отдельных бактериальных клеток. Повышает устойчивость биопленок к вредным факторам присущее им генетическое и фенотипическое разнообразие, которое позволяет им переносить большинство терапевтических воздействий.
Существуют три основных механизма защиты микроорганизмов в условиях биопленки. (1) Блокировка, которую осуществляет полисахаридный матрикс, синтезированный микроорганизмами данного сообщества, препятствуя проникновению эндогенных и экзогенных факторов защиты. (2) Взаимная защита, которая обеспечивается самими микроорганизмами, входящими в состав биопленки, когда они обеспечивают собственными защитными механизмами всех «жителей микробного города»: защитные энзимы, антибиотик-связывающие протеины, обмен плазмидами. (3) Бездействие - это стратегия выживания, необходимая для существования микроорганизмов в условиях биопленки, так как большинство антибактериальных механизмов направлено на активные процессы метаболизма микробов.
Плазмида - это мобильная кольцевая низкомолекулярная ДНК, несущая поведенческий код для членов биопленки, определяющая их трофические, энергетические и другие связи между собой и окружающей средой - в частности, иммунокомпетентным организмом. Таким образом, биопленка, как сообщество микроорганизмов, формирует единую генетическую систему в виде плазмид. Последнее получило специальное определение как социальное поведение микроорганизмов - так называемый «quorum sensing» («чувство кворума»). Этот механизм позволяет бактериям действовать коллективно, подобно клеткам в многоклеточном организме. «Чувство кворума» позволяет бактериям обмениваться информацией с помощью специализированных химических молекул. Система «quorum sensing» следит за плотностью клеток бактериальной популяции и связана с изменениями в метаболизме бактериальных клеток, восприятием клетками изменений среды и реакцией на эти изменения при достижении бактериальной культурой некоторой пороговой численности. Сигнальные молекулы систем «quorum sensing» бактерий могут узнаваться эукариотическими клетками хозяев бактерий и индуцировать специфические ответы.
Все больше накапливается доказательств, что выделенная чистая культура бактерий совпадает с биопленкой только по небольшому числу свойств. Когда бактерии переходят от планктонного фенотипа к формированию биопленки, процессы их биосинтеза радикально меняются. Клетки начинают синтезировать полимеры, защищающие их и связывающие между собой и с подлежащей поверхностью. Кроме того, клетки (даже разных видов) обмениваются между собой информацией с помощью феромонов и других сигнальных молекул. Скоординированная активность сообщества микробов делает биопленки малоуязвимыми для факторов защиты макроорганизма.
Представления о планктонном существовании бактерий накладывают ограничения на диагностические и терапевтические возможности современной медицины. Поскольку планктонные клетки хуже защищены, чем биопленки, то антибиотик, высокоактивный in vitro при тестировании в чистой культуре, при испытаниях in vivo (когда преобладает фенотип биопленок) может оказаться неэффективным. Этим может объясняться по крайней мере часть различий в результатах испытаний антибиотиков in vitro и в клинических условиях.
Кроме того, традиционные бактериологические методы не выявляют большинство бактерий, участвующих в инфекционном процессе. Новейшие молекулярные, геномные, транскрипционные и протеомные методы позволили определить, что при выделении чистой культуры определяется лишь около 1% клеток патогенного микробиоценоза. В результате лечение нацелено лишь на 1 - 2 вида бактерий из множества штаммов, присутствующих в составе биопленки (в том числе, возможно, и грибов). Наконец, ограниченные возможности культуральных методов приводят в ряде случаев к ошибочному или неполному диагнозу. Поскольку эти методы не выявляют те бактерии в составе биопленок, которые жизнеспособны, но не культивируются, то зачастую делается заключение о «стерильном воспалении» или вирусной инфекции (например, при среднем отите или простатите).
Сейчас не вызывает сомнений необходимость пересмотреть концепцию патогенеза различных хронических инфекций, внедрив в нее имеющиеся данные о биопленках. В практическом отношении это требует использования новых методов диагностики и лечения. Среди методов, которые позволяют идентифицировать микроорганизмы в составе биопленок, можно назвать современные молекулярные методы: электрофорез в геле и высокоэффективная жидкостная хроматография с флюоресцентной гибридизацией in situ, газовая хроматография и ее сочетание с масс-спектрометрией (при газовой хроматографии детектирование микроорганизмов в составе биопленки проводится по специфичным жирным кислотам, в различных биологических жидкостях; в основе метода лежит высокоточное определение специфических маркерных молекул, входящих в состав клеточных липидов). В клинических лабораториях всё шире используются полимеразная цепная реакция (ПЦР), ПЦР с обратной транскриптазой, быстрое секвенирование и другие исследования.
Можно ли увидеть микробную биопленку? Биопленки - это микроскопические структуры. Однако в некоторых ситуациях, когда им дают возможность расти беспрепятственно в течение продолжительного периода времени, они становятся настолько плотными, что их можно увидеть невооруженным глазом. Например, зубной налет может накапливаться и становиться четко видимым в течение дня. Некоторые бактерии из фенотипа продуцируют пигменты, что может способствовать визуальной детекции всей биопленки. Например, P. аeruginosa, находясь в фенотипе биопленки, в системе «quorum sensing» продуцирует молекулярный пиоцианин зеленого цвета (но следует помнить, что зеленое окрашивание раны не всегда свидетельствует о присутствии биопленки, сформированной Pseudomonas sp.). В настоящее время наиболее надежным методом подтверждения наличия микробной биопленки является специальная микроскопия, например, конфокальное лазерное сканирующее микроскопическое исследование.
На данный момент наиболее перспективными представляются следующие направления борьбы с биопленками: 1) предотвращение первичного инфицирования имплантатов; 2) минимизация начальной адгезии микробных клеток; 3) разработка методов проникновения через матрикс биопленки различных биоцидов с целью подавления активности клеток внутри биопленки; 4) блокировка синтеза или разрушение матрикса; 5) нарушение межклеточного обмена информацией.Предотвращение адгезии клеток можно вызвать при введении в систему гидрофобных агентов, которые тормозят взаимодействие бактерий с субстратом. Это наблюдалось, например, в присутствии р-нитрофенола, который почти полностью подавлял адгезию P.aeruginosa в культуре пневмоцитов человека. Следует отметить также, что материал, из которого изготовлена колонизируемая бактериями поверхность, его физико-химические свойства (гидрофильность, электрический заряд, инертность, гладкость), играют важную роль в возможности и скорости образования биопленок (см. далее).
Для борьбы с уже образованными биопленками может использоваться разрушение матрикса биопленок с помощью различных ферментов. Например, ферменты папаин, трипсин и ферментный комплекс вобэнзим могут не только частично угнетать образование микробных биопленок, но и усиливать действие на них различных неродственных антибиотиков, что свидетельствует о неспецифичном общем увеличении поступления препаратов в биопленки. Одним из хорошо изученных матрикс-деградирующих ферментов является дисперсин В-гликозидгидролаза. Дисперсин В разрушает один из главных матриксных полисахаридов, поли-N-ацетилглюкозамин и подавляет в результате образование биопленок. Однако, этот фермент не действует на биопленки всех бактерий – например, такой важный патоген, как P. aeruginosa, лишен поли-N-ацетилглюкозамина. Мукоидный (альгинатный) матрикс P. aeruginosa разрушается cобственным ферментом, альгинатлиазой.
N-Ацетилцистеин уменьшает адгезию некоторых возбудителей к слизистым оболочкам дыхательных путей, а также оказывает прямое разрушающее воздействие на внеклеточный матрикс, что позволяет рассматривать его в качестве перспективного неантибактериального компонента терапии инфекций, связанных с образованием биопленок. Было показано, что при его использовании уменьшение биопленок, продуцируемых золотистым стафилококком, происходит за счет снижения объема мукополисахаридной составляющей внеклеточного матрикса. Внеклеточная ДНК матрикса биопленок также может быть мишенью для борьбы с биопленками, для этого могут быть использованы различные ДНК-азы.
Среди современных подходов к блокированию образования биопленки можно выделить фаготерапию - разрушение биопленки синтезированным бактериофагом. Фаготерапия имеет значительное преимущество перед антибиотикотерапией за счет экологичного воздействия на биотопы организма. Бактериофаги повреждают лишь определенные бактериальные клетки, не нарушая при этом естественный биоциноз различных систем организма. Также одним из самых успешных физических методов воздействия на биопленку, по данным литературы, признана фотодинамическая терапия с использованием диодного лазера с длиной волны 635 нм. Для борьбы с биопленками могут успешно использоваться наночастицы серебра.
С такой проблемой, как колонизация твердых поверхностей (имплантатов, катетеров, эндотрахеальных трубок и т.д.) можно выделить два способа борьбы. Первый из них касается использования материалов, способных длительное время самостоятельно противостоять колонизации. Так, установлено, что полиуретан, тефлон и силикон являются более «благонадежными» материалами, с точки зрения скорости контаминации, для изготовления сосудистых катетеров, нежели полиэтилен. Аналогично, синтетический монофиламентный шовный материал также имеет преимущества по сравнению с плетеной хирургической нитью натурального происхождения. Разновидностью данного подхода является и разработка специальных покрытий или импрегнация материала биоцидом (собирательное понятие, включающее антибиотики, антисептики, дезинфектанты), препятствующим колонизации. Попытки повышения антиинфекционной безопасности таким путем предпринимаются уже несколько десятилетий, однако наиболее ярким и успешным примером является покрытие/импрегнация хирургического шовного материала триклозаном.
Следующим подходом к предупреждению образования биопленок является использование различных биоцидов в чистом виде для ухода за имплантируемыми устройствами, которые в силу технологий использования неотвратимо подвергнутся колонизации. Примерами подобных устройств являются сосудистые и мочевые катетеры, некоторые виды шунтов и стентов, имплантируемые порты для гемодиализа и т.д. По ряду объективных причин, лучший метод лечения – извлечение устройства не всегда приемлем, поэтому здесь также имеется большое количество предложений, касающихся использования различных препаратов для профилактики образования или борьбы с биопленками. Следует отметить, что идеальными агентами для использования в таких целях являются именно антисептики, обладающие в данном аспекте несомненными преимуществами перед антибиотиками. К таким преимуществам относятся, прежде всего, неспецифический механизм действия (и связанное с этим отсутствие риска развития истинной устойчивости возбудителей), а также прогнозируемая фармакокинетика при местном применении. Хорошим примером доказательной базы профилактики или терапии катетер-ассоциированной инфекции кровотока обладает тауролидин, используемый в форме раствора для закрытия сосудистых катетеров. В то же время, обычный гепарин, обладающий свойствами «растворения» субстрата - образовавшейся биопленки в сосудистом устройстве, также рекомендуется рядом локальных руководств по уходу за катетерами.