Сепсис: современные методы лабораторной диагностики
Актуальность. Стратегия лечения сепсиса у больных основывается на быстром применении эмпирической антибиотикотерапии. Одновременно у пациента берется кровь на бактериальный посев. Это позволяет значительно снизить летальность при данном тяжелом осложнении. Однако срок культивирования посевов составляет 7 суток, и результат микробиологического анализа может быть получен самое раннее через 24 - 48 часов и может лишь подтвердить инфекционную этиологию и идентифицировать возбудителя (к тому же микробиологический метод малоприменим для культивирования микоплазм, нокардий, риккетсий, хламидий и др. - для их диагностики используются серологические и молекулярно-биологические методы). Таким образом, роль бактериологи ческой лаборатории в первый критический период возникновения сепсиса невелика, и успех лечения полностью определяется правильностью проводимой эмпирической антибиотикотерапии. В случае неэффективности проводимой эмпирической терапии критическое значение приобретает быстрая корректировка лечения, так как каждый час ее задержки повышает вероятность летального исхода на 5 - 8% (Kumar A., Roberts D., Wood K.E., et al., 2006). В этот период выявление возбудителя и определение его чувствительности к антибиотикам приобретает решающее значение. В связи с этим понятен интерес к разработке быстрых и в тоже время чувствительных методов диагностики сепсиса и оценки его тяжести.
Терминология (согласительная конференция Американской ассоциации пульмонологов и Общества интенсивной терапии, 1992): сепсис является одной из форм «синдрома системной воспалительной реакции» (ССВР), когда последний возникает вследствие инвазии микроорганизмами при наличии очага инфекции, при этом у пациента должно быть не менее двух любых из четырёх признаков ССВР:
температура тела больше 38 оС или менее 36 оС;
частота сердечных сокращений более 90 в минуту;
частота дыханий более 20 в минуту или артериальная гипокапния менее 32 мм рт.ст;
лейкоцитоз более 12 000 в мл или лейкопения менее 4 000 мл, или наличие более 10% незрелых форм нейтрофилов.
Отдельно выделяют: тяжелый сепсис , характеризуется органной дисфункцией, нарушением тканевой перфузии и гипотензией, и септический шок - тяжелый сепсис с тканевой и органной гипоперфузией, гипотензией, не поддающийся адекватной инфузионной терапии.
Современные методы лабораторной диагностики. В.Н. Чеботкевич, Е.И. Кайтанджан, В.В. Бурылев, Е.Е. Щетинкина (Российский НИИ гематологии и трансфузиологии ФМБА России, Санкт-Петербург, Россия; 2013) провели обзор применяемых микробиологических и молекулярно-биологических методов лабораторной диагностики сепсиса.
Технологии нуклеиновых кислот (NAT-технологии). Для индикации бактерий в крови используют выявление участка генома, общего для всех бактерий (чаще всего 16S РНК), с помощью ПЦР. В дальнейшем в полученном амплификоне выявляют участки, специфичные для определенных групп бактерий. Например, разработана методика на основе ПЦР «в реальном времени» для молекулярно-биологической индикации бактерий и опре-деления их грампринадлежности в различных биоматериалах. Методика может быть использована, в частности, для определения бактериальнойконтаминации тромбоцитарной взвеси. Показано, что метод позволяет определять микробную контаминацию при содержании бактерий 10*1 - 10*2 КОЕ (колониеобразующих единиц) в 1 мл. Метод ПЦР «в реальном времени» используется также для групповой и видовой идентификации бактерий, выявленных в крови. Кроме того, этот метод позволяет оценивать количество микробов в исследуемом материале. Большое число потенциальных возбудителей сепсиса, конечно, ограничивает возможности их видовой идентификации с помощью ПЦР. К настоящему времени разработаны наборы только для выявления основных возможных возбудителей. Однако даже эти наборы первого поколения нашли практическое применение. Накоплен определенный опыт их использования в ряде стран Европы, в том числе и в России. В настоящее время имеются два подхода к применению NАТ-методов для диагностики сепсиса: использование ПЦР для быстрой видовой идентификации микроорганизмов, выявленных микробиологически (после автоматического культивирования) и прямое выявление нуклеиновых кислот бактерий и грибов непосредственно из биоматериала.
Разрабатываются также методы выделения ДНК непосредственно из биоматериалов – образцов цельной крови, плазмы и сыворотки. Экстракция из образцов цельной крови, обработанной ЭДТА, позволяет получить большее количество бактерий, чем при выделении из сыворотки или плазмы. Однако присутствие ингибиторов ПЦР в цельной крови снижает чувствительность этого метода. Показана более высокая чувствительность образцов сыворотки для диагностики бруцеллеза, несмотря на то, что представители рода Brucella являются факультативными внутриклеточными паразитами. Это говорит о необходимости выбирать протокол экстракции при разработке стандартной процедуры выделения. Существуют автоматизированные системы прямой экстракции ДНК из цельной крови. Однако их высокая стоимость ограничивает использование в практических лабораториях.
Дальнейшее совершенствование NAT-технологий диагностики позволит внедрить их в работу практических микробиологических лабораторий. На сегодняшний день, наряду с методологическими трудностями, главным препятствием внедрения NAT технологий является их высокая стоимость, однако развитие и совершенствование этих методов, безусловно, позволит удешевить их проведение и ввести NAT-тестирование в алгоритм диагностики сепсиса.
Протеомные технологии с использованием время-пролетной масс-спектрометрии ( MALDI-TOF MS) позволяют идентифицировать бактерии и грибы по их белковому профилю. Также он позволяет определять некоторые маркеры антибиотикорезистентности. Основным недостатком данной технологии является невозможность ее применения непосредственно для биологических образцов. Здесь требуется предварительное культивирование образцов для увеличения числа микробных тел в пробе. Кроме того, ввиду большой стоимости оборудования этот метод является недоступным для многих лабораторий.
Ряд методов используется для идентификации микробов в положительных микробиологических пробах. Наиболее изученным из не микробиологических тестов является PNA-FISH (AdvanDX, США). Метод основан на гибридизации in situ флуоресцентно меченных пептидно-нуклеотидных проб к ограниченному набору бактерий. Метод удобен для использования, и анализ может быть выполнен за 3 часа. Заявленная фирмой чувствительность и специфичность метода близка к 99 - 100%. В наборе Hyplex BloodScreen (BAG, Германия) используется мультиплексная ПЦР. Возможна идентификация нескольких бактериальных видов, включая метициллино-чувствительные и метициллино-резистентные штаммы стафилококков, стрептококков и энтерококков, а также грамотрицательных бактерий (E. coli, Enterobacter aerogenes, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella spp.). Продолжительность проведения исследования 3 – 4 часа при заявленной чувствительности в дифференцировке различных видов от 96,6 до 100% и специфичности от 92,5 до 100%. Метод позволяет определять маркеры резистентности – гены van и несколько генов -лактамаз. Недавно предложен набор с использованием метода микрочипов для определения большого количества видов бактерий и гена mecA (Mobidiag, Финляндия). Анализ занимает 3 часа с заявленной чувствительностью 94% и специфичностью 96%.
Разрабатываются также методы по индикации микробов непосредственно из крови. Набор SepsiTest (Molzym, Германия) представляет собой метод, основанный на выявлении генов 16S рРНК бактерий и генов 18S рРНК грибов. Потенциально этот метод позволяет провести полную видовую дифференцировку бактерий и грибов с помощью секвенирования генома. Однако имеется большой риск контаминирования пробы на пост-амплификационном этапе исследований и получения ложноположительных результатов. Кроме того, секвенирование для его проведения требует 8 - 12 часов, что не позволяет рассматривать его как метод ранней диагностики сепсиса.
Набор Vyoo (SIRS Lab, Германия) предствляет собой метод, основанный на мультиплексной ПЦР, позволяющий выявлять 35 видов бактерий, а также ряд генов антибиотикорезистентности (гены -лактамаз, а также гены vanА, vanВ и mecA). Общее время проведения анализа – 8 часов при заявленной чувствительности 3 - 10 КОЕ/мл. Набор LightCycler SeptiFast Test ( Roche Molecular Systems, США), представляет собой тест-систему в формате мультиплексной ПЦР «в реальном времени» для диагностики сепсиса. Тест-система позволяет идентифицировать около 25 видов бактерий и грибов – возбудителей нозокомиальных септицемий.